Способ дифференциальной диагностики

Способ дифференциальной диагностики и питательная среда

при массовом исследовании на выявление бруцеллеза

А.А. Алыев, Н.Г.Гулиев, А.А.Бабаев

Г. Г. Халилов, Ф. Гянджалиев О. М. Садыглы

Анализ литературы, описывающей передовые технологии и последние достижения науки. Вопросами диагностики бруцеллеза занимались многие исследователи (Вышелесский, Николаев, Юсковец, Орлов, Голубев, Вершилова, Котлярова и. др). Однако, до настоящего времени не были найдены методы, доступные массовому пользователю в производственных условиях и обеспечивающие выявление всех зараженных животных в короткий срок. Сложность этой проблемы заключается в своеобразии течения самой инфекции, так как иммунологическое состояние животного может варьироваться – инкубационный период, острая или латентная форма, выявить которые при помощи одного какого – либо диагностического метода иногда не представляется возможным. В настоящее время известно несколько методов лабораторной диагностики: серологический (РБП, РА, РХ, РСК, РКМ и. др). Но ни один из упомянутых способов не гарантирует выявление всех больных животных, находящихся в острой и хронической стадиях бруцеллеза. В результате этого возникает риск невыявления зараженных животных, продолжающих рассеивать инфекцию. Однако, существующие методы бактериологических исследований бруцеллеза людей и животных не всегда дают необходимые результаты в случаях несомненного наличия заболевания. Выявить хронические формы бруцеллеза прямым посевом на питательную среду не всегда удается.

Бруцеллез – это зооантропонозная инфекция (болезнь), которая наносит ущерб и снижает до 50% фактической стоимости каждого животного вследствие принудительной бойни в животноводческих хозяйствах. В настоящее время государством осуществляется ряд мер по ликвидации бруцеллеза, увеличивают количество профилактических мероприятий, ведутся научные исследования, но, несмотря на это, ликвидация этого заболевания остается актуальной проблемой.

В борьбе с заболеванием одной из важных задач является правильная постановка диагноза, вовремя выявить больное животное, отделить его от остального хозяйства и обеззаразить место его прибывания. Во всём мире при обнаружении инфекционных заболеваний серологические исследования проводятся в 2-х направлениях:

1. При помощи антигена выделяются антитела в сыворотке исследуемого животного.

2. Также возможен обратный процесс – при помощи сывороток (специфических антител) находятся антигены (микроб, вирус и т.д.)

Сегодня диагноз бруцеллез ставится в случае обнаружения специфических антител в сыворотке при проведении серологической диагностики (РА, РСК, РДСК, РПБ, КРМ и. т.д.)

Исходя из нашего мнения, метод обнаружения антител в сыворотке имеет как плюсы, так и минусы…

Анализируя ниже указанные научные достижения, реальные события, а также провёдённые нами некоторые научные исследования и т.д, мы пришли к выводу о том, что правильно было бы искать сам микроб, а не антитела!

Хотелось бы обратить ваше внимание на некоторые научные исследования, проведенные учеными со всего мира в разные периоды времени по этому вопросу. Мнение ряда авторов: [1]. Р. Кох (1882) начал свои исследования в то время, когда роль микроорганизмов в этиологии инфекционных заболеваний подвергалась серьезным сомнениям. Для ее доказательства требовались четкие критерии, которые были сформулированы Кохом и вошли в историю под названием «Триады Генле - Коха». Суть триады заключалась в следующем:

1. Предполагаемый микроб - возбудитель должен быть обнаружен только при данном заболевании, не выделяться при других болезнях, а также у здоровых лиц;

2. Микроб – возбудитель должен быть выделен в чистой культуре;

3. Чистая культура данного микроба должна вызывать у экспериментальных зараженных животных заболевание с клинической и патологической картиной, аналогичной заболеванию человека.

[2]. Английский исследователь Девид Брюс в 1886 году впервые наблюдал под микроскопом, множество маленьких микроорганизмов в препарате, приготовленном из селезенки мертвого солдата, умершего от лихорадки Мальты. Годом позже, Брюс отделил чистую культуру фактора болезни и дал ей название Mikrococcus melitensis. Далее он заразил обезьян чистой культурой микрококков в экспериментальных целях и наблюдал у них схожие с человеком клинические признаки болезни.

[3]. Огромное значение для распознавания бруцеллеза имело обнаружение Райтом и Смитом (Wright a Smith 1897) способности сыворотки крови больных мальтийской лихорадкой агглютинировать микрококи Брюса. Вскоре Райт и Семпл (Wright a. Semple, 1897) предложили метод серодиагностики ундулирующей лихорадки с применением убитой культуры Мальтийского микрококка в целях диагностики.

[4]. Немецкий исследователь Рихард Пфейфер и русский микробиолог В.И. Исаев (1894) при прививании ослабленных холерных вибрионов морской свинки наблюдали появление специфических антител в кровяной сыворотке, далее они подвергли ее лизису при участии комплимента с добавлением in-vitro живых холерных вибрионов, и назвали этот случай реакцией бактерилизиса.

[5]. Э. Ру и А.Иерсен впервые выделили дифтерийный экзотоксин, что объяснило патогенетические особенности дифтерии. Через несколько лет Э.Ру и Э.Беринг получили антитоксическую противодифтерийную сыворотку, спасшую сотни тысяч детей от смерти, а в 1894 г. Г.Н.Габричевский наладил ее производство в России.

[6]. И. Борде (1898), Ф. Чистович (1899) обнаружили, что при повторном введении эритроцитов овец и кроликов, в их кровяной сыворотке при участии комплементов образуются специфические антитела гемолизина, который лизируют эритроциты овец.

[7]. И. Борде, О. Жангу (1901) – соединив комплемент при добавлении реакции бактериолиза и гемолиза, воспроизвели реакцию соединения комплемента.

[8]. Широкая дискуссия развернулась вокруг вопросов о диагностическом титре и специфичности реакции Райта при диагностике бруцеллеза. Поводом для этого послужили сообщения ряда авторов о том, что некоторое нормальные сыворотки человека и животных агглютинируют под влиянием мальтийского микрококка, и, в еще большей степени, сообщения о положительной реакции Райта у небруцеллезных больных (Конрих 1904, Негр 1910, Рэно 1911-1912).

[9]. Нобелевские премии по физиологии и медицине, присужденные за работы в области иммунологии. Эмиль Беринг – (1854-1917) Германия-премия 1902 г. за открытие антитоксинов, впоследствии антител.

Илья Ильич Мечников (1845 - 1916 Россия) – премия 1908 г. за открытие защитной роли фагоцитоза и клеточную теорию иммунитета.

Пауль Эрлих (1854-1915 Германия) - премия 1908 г. (совместно с И.И.Мечниковым) за гуморальную теорию иммунитета. Жюль Борде (1870-1961 Бельгия) – премия 1919 г. за экспериментальные работы по комплемент зависимому бактериолизу, специфическому гемолизу, разработку метода фиксации комплемента для диагностики инфекционных болезней.

[10] Гольт (1909) – предложил применять КБР при диагностике бруцеллеза.

[11] Исследования, проведенные Ивенсом (1918) – в результате было обнаружное тесное родство между возбудителями эпизоотического аборта у коров, коз, овец и свиней. Естественно, был выдвинут вопрос о роли Br.abortus и Br.suis в патологических процессах, протекающих в организме человека. Этот вопрос, помимо теоритического интереса, имел большое практическое значение, поскольку было известно широкое распространение эпизотического аборта среди крупного рогатого скота и свиней, а также выделение палочки Банга из молока инфицированных коров (Шлосман, 1930). Более того, в литературе уже появлялись сообшения о положительных результатах серологических реакциях у людей, употреблявших в пищу сырое молоко животных, пораженных инфекционным абортом (Николь и Конор, 1912, Ларсон и Седжвик, 1913 и др.). Кулидж (1916) даже поставил эксперименты на людях (добровольцах) с употреблением инфицированного молока, но только в одном случае наблюдалось появление агглютининов в крови и с невысоким титром. Все эти опыты проводились над практически здоровыми людьми. Попытки подтвердить специфичность положительных серологических реакций выделением культуры возбудителя оказывались безрезультатными. Малоубедительными были сообщения и о клинических случаях возникновения мальтийской лихорадки без «козьего» анамнеза (Бирт и Лимб, 1899; Крейдж, 1906, Кэлд, 1921, и др).

В таких случаях предполагается, что культура или не было получена, или не представлялось возможным ее дифференцировать от мальтийского микрококка. Не удалось возбудить заболевание и экспериментальным заражением людей (добровольцев) лабораторными штаммами палочек аборта коровьего и свиного происхождения (опыты Николя и Бюрне, 1923).

[12] По данным Бюрне, 1925, Джоиордано 1929, Кристензен и Холм 1929, Лустиг и Вернони, 1928, встречаются и такие больные, сыворотка которых не агглютинирует ни лабораторными штаммами мальтийского микрококка, ни аутоштаммов.

[13]. С точки зрения практического использо¬вания реакции Райта, весьма существенным является вопрос о том, какой титр ее может быть признан достоверным для диагностики бруцеллеза. Совершенно справедливо замечает Деттлинг (1932), что наличие агглютининов в крови еще не означает наличия болезни. Однако, единства мнений в данном вопросе нет. Достоверными для диагноза бруцеллеза различные авторы считают титры от 1:10 до 1: 1000 ([Вэрт и Лэмб 1899], Ивенс 1925, Бендтсен 1954, Грилихесс, 1930, Олин 1935, Вейгман 1931 и др. Вряд ли такое разногласие имеет сколько - нибудь серьезное основание. Реакция Райта в достаточной степени специфична, и при соблюдении всех требований техники ее выполнения опасения получить положительный результат с высоким титром при заболеваниях небруцеллезной природы весьма невелика.

[14]. Вопрос о специфичности реакции Райта представляет практический интерес. Он возник в связи с сообщениями ряда авторов о положительной реакции Райта у небруцеллезных больных: при сыпном тифе (Аллесандрини 1934, Феликс 1918, Николь и Конт 1910), при туберкулезе (Алессандрини 1934, де Антони 1934, Конрих 1904, Вегенер 1935), при туляремии (Бюрне 1927, Френсис 1926, Жирар 1950). Некоторые авторы наблюдали положительную реакцию Райта у беременных женщин (М.Л.Федер и А.П.Выговский 1943, Камада 1931, Зингер 1930). Все подобного рода сообщения явились основанием для различных толков относительно специфичности реакции Райта. Одни авторы считали ее в высокой степени специфичной (А.П.Вычовский и В.П.Игнатова 1937), другие, напротив, оспаривали это мнение, указывая, что она может быть положительной при многих заболеваниях небруцеллезной природы.

Несколько иные результаты были получены при испытании сыворотки больных сыпном тифом. Одними авторами положительная реакция Райта не была обнаружена даже в разведении сыворотки 1:20 (Спинк, Мак Куллар, Гетчингс, Мингл 1954).

[15]. У овец, заразивщихся бруцеллезом естественным путем, реакция агглютинации обнаруживается примерно в те же сроки, что и у крупного рогатого скота. Время появления агглютининов и титр сыворотки в РА зависит от дозы и вирулентности возбудителя, от места введения и состояния организма животного. При экспериментальном заражении овец разные авторы устанавливали примерно следующие сроки появления РА: Гурвич (1934) – на 7-й день; Киселев, Новиков, Яковлев (1934) на 7-50-й день; Тарасов (1937) на 10-50-й день. При введении культуры слабовирулентных штаммов у овец РА обнаруживается уже на 4-й день (Юскавец, 1951). По данным Орлова (1949), у искусственно зараженных ягнят агглютинины в крови появлялись на 10-30 и день. Х.С.Котлярова (1950) обнаруживала агглютинины в крови экспериментально зараженных овец в течение 4-7 и 25-30 месяцев.

[16] Б. П. Первушин (1937, 1941, 1947) – Каждый случай положительной реакции Райта, полученной с использованием сыворотки больных, у которых на данный момент не обнаружена клиническая картина, характерной для бруцеллеза, необходимо подвергать дополнительным исследованиям специальными методами на наличие последнего, не игнорировать показания реакции Райта и, тем более, не делать преждевременного заключения о ее неспецифичности. Во всяком случае, если последнее и имеет место быть даже при исключении всех «вредных» моментов, рассмотренных выше, то, в очень редких случаях, и, по-видимому, прежде всего при сыпном тифе, туляремии и холере, а также у больных, привитых противохолерной вакциной.

[17]. Метод РА был испытан при бруцеллезе людей и животных многими исследователями (Котлярова 1937, Орлов 1940, 1954, Студенцов 1948, Вышелесский 1954). Все исследователи пришли к одному мнению: РА специфична и является хорошим диагностическим методом на ранних стадиях развития инфекционного процесса или при обострениях хронического бруцеллеза; в случаях же затяжных хронических форм бруцеллеза РА часто выпадает. Однако, существующие методы бактериологического исследования при бруцеллезе у людей и животных не всегда приводит к положительным результатам в случаях несомненного заболевания (Первушин 1937, Стольников 1939, Орлов, Корнеева 1940). Так, при наличии в исследуемом материале посторонней микрофлоры (органы трупа, загрязненный материал), а также при незначительной концентрации в нем возбудителя, например, при хронических формах или после аборта, выделить культуру бруцелл прямым высевом на питательные среды не всегда удается, и поэтому в таких случаях прибегают к биологическому методу заражения инфицированным материалом лабораторных животных, из них наиболее чувствительными к бруцеллезу являются морские свинки и белые мыши.

[18]. В. А. Штритер, Х.С. Котлярова, П.А.Вершилова 1937, 1943, 1949 – Длительность течения бруцеллезной инфекции изучена на 169 овцах, экспериментально зараженных Br.melitensis, путем применения групповых бактериологических исследований на разных этапах развития инфекцин. У овец с латентным бруцеллезом в отдаленные сроки после заражения не удается выделить возбудителя инфекции; крайне редко наблюдается положительный результат посева.

[19]. Поп, Дамбосичеану, Барбер, Маринов, 1938-39 и др. было установлено, что полные антигены, извлеченные из R – форм всех типов, малотоксичны, не реагируют на преципитации специфическими сыворотками и не обладают антигенными свойствами. Полные антигены, извлеченные из S – форм, были токсичны для белых мышей, морских свинок и кроликов (в особенности из Br.sius, в меньшей степени из Br.melitensis и еще менее из Br.abortus), они четко реагировали в реакции связывания комплемента (РСК) на гомологичные и гетерологичные сывыротки, проявляя в больщих разведениях типовую специфичность, обладали антигенными свойствами, стимулировали фагоцитарную реакцию крови у морских свинок и давали выраженную аллергическую реакцию у морских свинок и овец на введение доз 0,0001-0,01 мл, а у людей на дозу 0,01 мл (П. А. Вершилова, 1941).

[20]. Сыворотки крови исследуемых животных обрабатывали по методу В.И.Иоффе (1940), принцип которого состоит в осаждении антигена, находящегося в крови, путем подкисления сыворотки с помощью СО2.

[21]. Наставления, касающиеся изготовления и использования агглютинирующей бруцел¬лезной сыворотки (1944) – избранные штаммы культур в на мясо-печеночном агаре с добавлением 0,5% глюкозы в термостате в течение 2-3 дней при температуре 37-380Ц, после чего смываются стерильным физиологическим раствором и уничтожаются нагреванием в водяной бане при 700 Ц в течение одного часа. Концентрация культуры 10 млрд. микротел в 1 см3. После проверки на стерильность используется для инъекции животным.

[22]. П. Н. Жованик (1946) – Часто больные бруцеллезом животное обильно и длительно выделяет возбудителя болезни с молоком. По данным многих исследователей, такого рода выделение бруцелл наблюдается у большинства коров (60-100%), дающих положительную реакцию агглютинации (РА) с сывороткой крови в высоком титре. Иногда выделение бруцелл с молоком наблюдается у животных неблагополучного стада, которые реагируют по РА низким титром или отрицательно.

[23]. С. И. Попова (1947) обследовав 428 больных бруцеллезом различных форм, установила, что переход преддиагностического титра реакции Райта (1:80-1:100) в диагностический (1:200 и выше) происходит не в первый день лихорадочного состояния больного, а позднее.

[24]. Ряд авторов – Лоран (1948), Дюбуа и Солье (1931), Кисилев, А.П.Новиков, П.А.Яковлев (1934, 1948), Х.С.Котлярова (1937), А.И.Качурин (1951) и другие, отмечают случаи получения отрицательных результатов исследования овец с помощью РА в период, когда из них была выделена культура бруцелл. По данным Сайковича, почти у половины абортируемых овец была установлена отрицательная реакция агглютинации.

[25]. Амелина (1949) – в наших исследованиях искусственно и естественно зараженных бруцеллезом животных, реакция агглютинации устанавливалась в титре 1:200, тогда как при убое результаты бактериологического исследования были отрицательные.

[26]. Многочисленными исследованиями было установлено, что развивавшийся в организме зараженного животного, а также человека бруцеллезный процесс со временем постепенно ослабевает, затухает и во многих случаях заканчивается самоизлечением. Это экспериментально установленное положение позволило П.Ф.Здродовскому (1948) обосновать новое представление об иммунитете при этой инфекции.

В сравнимых условиях опыта на морских свинках сопоставляли Br.abortus и Br.melitensis (П.Ф.Здровский и П.В.Воскресенский, 1930), а также Br.abortus и Br.suis (Харди и др. 1931) с целью обнаружения различий в патогенности у разных видов бруцелл. Результаты исследований были противоречивы, по этому выделить тот или иной вид бруцелл, как наиболее патогенный для морских свинок, не представлялось возможным.

[27]. М. Ганиев (1950) - если животному привить антигены в малом количестве, то мы увидим, что антигены самого организма уступают им по силе, в результате чего антигены, поступающие в организм, становятся сильнее. Если провести простой опыт по созданию иммунитета путем создания антител при введении антигена, даже при введении 10 смертных доз животному, в его теле антигены нейтрализуются и организм не погибает. Лошадь при получении одной дозы токсина создает 1.000.000 антитоксинных единиц. При введении 0,004 мг массы холерных вибрионов в кровь убитого кролика получается 60 мл сыворотки бактериолизина, это количество способно растворить 120 мл вирулентной культуры.

[28]. М. Ганиев (1950), К. Сафаров, Ю. Сафаров (1971), Р. А. Кадымов (1986, 1998) – хотя про иммунитет начали говорить еще в конце XIX века, в настоящее время по данному вопросу не имеется единого мнения. Этот вопрос еще полностью не уточнен и остается в качестве теории.

[29]. А. И. Дмитриев (1951, 1953) – указывает, что организм экспериментально зараженных животных сравнительно рано освобождался от бруцелл. В отдельных случаях уже через 21 день возбудитель болезни в организме экспериментальных телок не был обнаружен.

[30]. М. К. Юсковец (1952) – типичных бруцеллы у экспериментально зараженных овец и крупного рогатого скота не были обнаружены спустя 3 - 4 месяца после заражения.

[31]. М. К. Юсковец (1953) – Ценность реакции агглютинации при бруцеллезе сельскохозяй¬ственных и лабораторных животных, а также птиц состоит в том, что в крови заразившегося животного антитела обнаруживаются значительно раньше, чем успевают развиться клинические признаки. Появившиеся антитела обычно сохраняются в крови и в период течения болезни, а также некоторое время после исчезновения клинических признаков и даже после того, когда не удается обнаружить в организме возбудителя болезни. Когда при явных клинических признаках заболевания бруцеллезом и при положительных результатах бактериологического исследования РА может отсутствовать или проявляться слабых титрах. Так, у коров нередко в первые 5-10-15 дней после бруцеллезного аборта реакция может отсутствовать. Это же явление часто наблюдается в течение известного времени, предшествовавшего аборту. Большое количество абортирующих овец дает отрицательную реакцию агглютинации. Могут быть такие случаи, когда при отсутствии реакции агглютинации в организме животных обнаруживают бруцеллезный возбудитель. Иногда при исследовании искусственно и естественно зараженных животных реакция агглютинации обнаруживается в высоком титре (в разведении сывороток 1:200), в то же время при бактериологическом исследовании (при убое) возбудитель бруцеллеза у них же не обнаруживается.

[32]. - При патоморфологическом изучении действия сыворотки на зараженных бруцеллезом лабораторных животных, Кудрявцев (1954) установил, что белые мыши, инфицированные смертельной заражающей дозой бруцелл и не привитые сывороткой, в 80% случаев погибают в результате острой токсикоинфекции с картиной сепсиса и наличием выраженных некробиотических поражений в различных органах. При бактериологическом исследовании у них было установлена генерализованная форма бруцеллеза.

Зараженные той же дозой бруцелл белые мыши, привитые перед заражением противобруцеллезной сывороткой, остаются живыми, у них не наблюдается токсикосептических изменений, отмеченных при вскрытии павших контрольных животных.

[33].Значительные работы по испытанию молока кольцевой пробой с положительными результатами провели в Польше ученый Парнас с сотрудниками (1954). В Англии (1954) с помощью этой пробы исследовано 9 стад – 326 коров, дважды привитых вакциной (при рождении и через 2-3 года). В результате выяснилось, что бруцеллезные и вакцинированные коровы дают эту реакцию, но дифференцировать коров, привитых вакциной от естественно заразившихся представляется сложной задачей.

[34]. - Развитие бактериемии у морских свинок при заражении их вирулентной культурой Br.melitensis было прослежено Гаргани (1955). Им установлено, что уже через сутки после заражения в посевах вырастает почти одинаковое количество колоний из равных количеств единиц крови, взятой у разных животных. Позднее наблюдаются сильные колебания в количестве развиващихся колоний, что, по мнению автора, связано с неодинаковой индивидуальной реактивностью животных и неравномерным поступлением микроорганизмов в кровь из очагов. С 10-го дня бруцеллы в крови свинок уже не обнаруживаются. Титр антител нарастает, С 10-го дня РCK становится положительной, а с 20-го дня она положительна почти у всех животных.

[35]. М.А. Журнаковой (1959) из 75 коров неблагополучного по бруцеллезу стада, отрицательно реагировавших в РА, 34 оказались носителями бруцелл.

Диагностическая ценность КРМ установлена также при исследовании молока овец (П.Н.Дьченко, 1957), буйволов (М.К.Ганиев, 1962) и свиноматок (А.М.Гупаленко, 1967). Однако, необходимо учитывать, что КРМ с молоком часто может давать неспецифические реакции при исследовании молока от животных, больных маститом небруцеллезной этиологии, а также в период глубокой стельности и в первые дни после растела.

[36]. М.К.Юсковец (1960) – Очень важным достижением науки и практики является установление факта самовыздоровления животных от бруцеллеза. В настоящее время возможность самовыздоровления общепризнана и используется в воспроизводстве здоровых отар.

Важным шагом в борьбе с бруцеллезом, как людей, так и животных, является получение целого ряда различных вакцин, с помощью которых проводятся мероприятия с применением специфической профилактики бруцеллеза, что значительно облегчает, упрощает и удешевляет оздоровление неблагополучных хозяйств и позволяет предотвратить заражение людей, работающих в очагах энзоотического бруцеллеза.

Большое значение также, имеет разработка способов получения гипериммунной сыворотки, применение которой значительно ускоряет выздоровление людей и животных от бруцеллеза.

Выделение вирулентной культуры бруцелл, является прямым доказательством заболевания животных бруцеллезом. Возбудитель бруцеллеза можно получить из молока, из выделений родовых путей абортированных и неабортированных бруцеллезных животных, из паренхиматозных органов, костного мозга, лимфатических узлов, крови, содержимого сычуга абортированного плода. Для выделения чистых культур, бруцелл патологический материал высевают на соответствующие питательные среды. Однако этот метод не всегда дает нужные результаты. Поэтому, кроме посева, прибегают к биологической пробе путем прививки патологического материала подопытным лабораторным животным (морским свинкам, белым мышам, кроликам). Наиболее точным методом диагностики является бактериологическое выделение вирулентной культуры бруцелл от больного животного из абортированного плода. При попадании в организм возбудителя болезни в организме образуются антитела, служащие фактором, обезвреживающим патогенный агент (микроб или токсин). Вещества, которые при введении в организм вызывают образование антител, принято называть антигенами. Антиген должен быть чужеродным для организма, или, как принято называть, гетерогенным. Антиген должен обладать двумя основными свойствами: а) способностью при парентеральном введении в организм животного вызывать образование антител и б) способностью вступать в соответствующие реакции с образовавшимися антителами как в организме, так вне его (в пробирке). Первое свойства антигена называют антигенным действием, второе - антигенной реакцией.

Современные иммунологи считают, что антитела – это особые вещества крови, связанные с глобулином сыворотки, обладающие защитными функциями. Антитела образуют клетки, продуцирующие сывороточные белки, а главном образом клетки ретикуло-эндотелиальной системы, при воздействии соответствующего агента на центральную нервную систему, как регуляторный центр всех иммунологических процессов организма.

В современной иммунологии антитела подразделяются на три группы: а) нейтрализующие (антитоксины и антифер¬менты), б) литические (бактериолизини, гемолизины, цитолизины) и в) коагулирующие (прецини¬тины и агглютинины).

М.К.Юсковец (1960) - Однако, несмотря на широкий опыт использования разнообразных методов и средств диагностики бруцеллеза, практика до сих пор не имеет точного и удобного способа распознавания этой болезни. Каждый из существующих методов дает удовлетворительные результаты лишь при применении его в определенные фазы развития болезни. Поэтому правильно и своевременно установить степень распространения болезни в стаде и выявить всех заразившихся животных, особенно при обследовании стад в начале вспышки энзоотии, можно лишь при использовании целого комплекса диагностических методов. Многолетний опыт научных и практических работников показал, что обнаружить бруцеллез в стадах крупного рогатого скота, овец, свиней можно путем проверки их крови серологическими методами. Это наиболее распространенные и удобные методы диагностики, но и они имеют недостатки. Эти методы могут быть дополнены аллергическим исследованием, а также исследованием молока с помощью серореакции, биопробы, бактериологии, кольцевой пробы. Наиболее точным методом диагностики, является бактериологический – выделение культуры бруцелл от больного животного или из абортированного плода. Однако, и в этом случае о точности можно говорить лишь при нахождении возбудителя; отрицательный же результат исследования еще не является убедительным доказательством отсутствия бруцеллеза; кроме того, этим методом трудно провести массовую проверку скота. Наименее достоверным является клинический метод диагностики.

[37]. Фгенк Бернет (1899 - 1985 Австралия) и Питер Медавар (1915 -1987 Великобритания) – премия 1960 г. за исследования по искусственной индукции иммунологической толерантности.

[38]. Б.П.Первушин – нередки случаи, когда реакция Райта при многократной постановке в различные периоды инфекции, не выходит за пределы слабоположительного значения. Наблюдаются и такие случаи, когда аглютинины совершенно отсутствуют в крови больных или же титр их всегда оказывается ниже диагностического, несмотря на то что гемокультура может быть положительной.

[39]. А.А.Аливердиев (1962). Известные способы не позволяют выявить животных, находящихся в периоде иммунологической негативности и слабой реактивности организма при заражении бруцеллезом. Кроме того, известные способы не позволяют отличить животных, больных бруцеллезом, от животных, содержащих и сыворотки крови антитела, возникающие в результате вакцинации против бруцеллеза.

[40]. М.М.Ременцова, О.В.Постричева, С.И.Рыбалко (1969) - Вопросами диагностики бруцеллеза занимались многие исследователи. (Вышелесский, Николаев, Юсковец, Орлов, Голубев, Вершилова, Котлярова). Однако до настоящего времени не найдены методы доступные для массового использования в производственных условиях и обеспечивающие выявление всех зараженных животных в короткий срок. Сложность этой проблемы заключается в своеобразии течения самой инфекции, так как животные могут находиться в различном иммунологическом состоянии – инкубационном, периоде, в острой или латентной форме, выявить которые с помощью одного, какого-либо диагностического метода иногда не представляется возможным. В настоящее время известно несколько методов лабораторной диагностики: серологический (РА, РХ, РСК), бактериологический, биологический, микробиологический и внутрикожная аллергическая проба.

Но ни один из них не дает гарантии полного выявления больных животных при остром и хроническом течении бруцеллеза. В результате этого зараженные животные остаются невыявленными и продолжают рассеивать инфекцию.

Многими исследователями (Вышелесский, Мыхин, Бессонов, Тарасов, Орлов, Гуревич, Юскевич, Цион, Студенцов, Первушин, Морякова, Николаев, Арбузов, Островидов, Давыдов), обоснована высокая специфическая и диагностическая ценность этих реакций при диагностике бруцеллеза у человека и животных. В то же время авторы отмечают, что ни одна реакция в отдельности не обеспечивает выявления всех больных, так как каждая из них характеризует особое иммунологическое состояние, которое неодинаково в различные периоды течения инфекции.

[41]. Ценность РДСК для обнаружения антигена в ранней диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота было подвержена исследованиям К.М.Салмакова и Р.В.Сахаровой (1970). По их данным, в случае выявления свежих вспышек бруцеллеза крупного рогатого скота, животные отрицательно реагирующие в РА и РСК на наличие антител, но положительно в РДСК на наличие антигена, дальнейшем абортируют и реагируют положительно в РА и РСК на наличие антител.

[42]. А. В. Демченко (1970) проведены исследования с целью определения возможности обнаружения с помощью РДСК бруцеллезного антигена в сыворотке крови крупного рогатого скота при острой вспышке бруцеллеза.

[43]. Матур (1971), также сообщает о случаях выделения бруцелл с молоком у нереагирующих коров, хотя в общей сложности бруцеллы в молоке им были обнаружены у 52% коров и нетелей, абортировавших на почве бруцеллеза. Автор делает вывод о том, что коров в неблагополучных (оздоравливаемых) стадах должны обследовать на бруцеллез бактериологическими методами, если они не реагируют по серологическим реакциям. Таким образом, у некоторых животных в отдельных органах могут после генерализованного инфекционного прогресса локально находиться бруцеллы и периодически выделяться во внешнюю среду, хотя у таких животных в крови не обнаруживаются противобруцеллезные антитела.

[44]. П. Н. Жованник (1975) – Бактериоскопическое исследование материалов на бруцеллез редко дает положительные результаты. Кроме того, полиморфизм и изменчивость тинкториальных свойств бруцелл и других мелких бактерий не позволяет с достоверностью ставить бактериоскопический диагноз на бруцеллез.

В двух случаях при исследовании сыворотки крови от нетелей, абортировавших накануне взятия проб крови, антитела не были обнаружены ни в РА, ни в РДСК, но получены положительные результаты РДСК на наличие бруцеллезного антигена.

[45]. Р.В. Петров (1976) – иммунитет, это защита организма от веществ инфекционной и неинфекционной природы.

[46]. П.А.Триленко (1976) – неагглютинирущий вариант штамма №213 Br.suis, был введен нами подкожно 16 здоровым морским свинкам в дозе 5 млрд микробных тел. До заражения все подопытные животные реагировали по РА отрицательно, а через 1 месяц после обработки у 4 из них были обнаружены S – антитела, тогда как остальные 12 морских свинок не реагировали на бруцеллез до конца опыта, т.е. в течение 135 дней. У трех морских свинок №250, 300 и 265 реагировавших по РА через 135 дней после их обработки штаммом бруцелл, были выделены культуры бруцелл в S форме.

Второй неагглютинирущий вариант штамма Br.suis в R форме был введен подкожно в той же дозе 14 морским свинкам. Из 14 морских свинок через 1 месяц после их обработки не реагировали на бруцеллез по РА со стандартным антигеном только 4. Следовательно, отсутствие агглютинации у R-форм штаммов бруцелл не является показателем их неагглютиногенности. Если возбудитель бруцеллеза присутствует в организме, то диагностировать бруцеллез представляется невозможным при помощи существующих методов. У других животных находящихся в первой половине беременности, а также у половозрелых, но не стельных животных время от заражения до появления в крови антител или клинических симптомов болезни бывает неопределенным. Важно указать, что в течение всего этого времени животное не реагирует на бруцеллез в серологических или аллергических тестах, так как в его организме не возбуждалась специфическая иммунологическая перестройка.

Иногда случается так, что в лаборатории из абортированного плода выделяется культура бруцелл через 3 - 4 дня после аборта, а кровь, взятая от абортировавшей коровы или нетели в день аборта дает по РА и РСК на бруцеллез отрицательный результат.

[47]. Э. Алиев – (1980) анализ проведенных опытов показывает, что провести оздоровление скота только путем серологического обследования крайне сложно. Этот метод ведет к потере средств, времени, порче животных, а также переходу заболевания в другие хозяйства. При проникновении бруцелл в организм в S или R формах картина иммунопатогенеза бывает различной. Так, по причине того, что как бруцеллы циркулирующие во внешней среде, так и микроорганизмы, передающиеся в организм в экспериментальном порядке, имеют различный вид и биотип, а также имеют стадию S или R, почти невозможно обнаружить их с помощью одной стандартной позитивной бруцеллезной сыворотки или другим диагностическим тестом. Потому что бруцеллы, известные на сегодняшний день науке, имеют антигенный характер A -, M -, L- AR, R-AR форм.

Исследуемую культуру можно тогда отнести к группе бруцелл, когда она будет вести себя как стандартный бруцеллезный антиген. То есть, в обоих наблюдательных образцах и нормальный сыворотке будет получен отрицательный результат, а в позитивной сыворотке произошла бы небросавшаяся в глаза агглютинация.

При обследовании бактериологическим и биологическим путями образцы молока, дающие положительные и сомнительные результаты по бруцеллезу по молочной кольцевой реакции, культуры бруцелл не отделились.

[48]. Нильс Йерне – (1912-1994) Великобритания - премия 1984 г. за разработку теории идиотипических сетей. Кроме того, он разработал всемирно применяемый метод количественного подсчета антитела образующих клеток. Именно Н. Йерне является первым, кому принадлежит фундаменальная и по сей день основная идея иммунологии – идея клональности лимфоцитов, следовательно, клональности любого иммунного ответа.

[49]. Р.А.Кадымов, М.А. Тагизаде (1986) – микроб, попадая в организм, создает там раздражение как антиген, и происходят специфические иммунобиологические изменения. В этом случае, организм не является очагом инфекции и поступивший микроорганизм быстро уничтожается. Антитела по своему действию специфические, то есть создаются соответствующие антитела в крови заразившегося бруцеллезом и лептоспирозом, но оздоровленного человека и животного. Антитела, действующие против токсинов, нейтрализуют специфические токсины. По своему составу антитела бывают белкового происхождения и являются измененной формой глобулиновой фракции крови. В возникновении антител основную роль играют гамма глобулины. Между антигеном и антителом создание комплекса играет основную роль в защите организма. В итоге происходит расщепление организма. Антитела, оседая специальными рецепторами на антигены, делает легким их подвержение фагоцитозу.

[50]. - Р.Кадымов, Э.Агаева, З.Алескеров – (1992) С первых лет изучения механизма образования антител до настоящего времени не прекращаются попытки развить теории, в полной мере объясняющие все иммунологические процессы. Было высказано немало гипотез, объясняющих механизмы образования антител. Однако, они неточно объясняли вопросы касаемо иммунитета. Эти теории имеют сейчас исторический интерес, имеются новые гипотезы, основанные на современных данных о биосинтезе белка. Однако это теория не могла объяснить тот факт, что количество молекул, образующих антитела, находится в соответствии с количеством антигена, образование антител в отсутствии антигена, иммунологическую толерантность, ревакцинаторный эффект, процесс определения иммунологической памяти, вопрос о том, почему собственные белки не вызывают образование антител, аутоиммунных заболеваний, распознавание «своего», почему одна клетка вырабатывает один тип антител, причины увеличения количества клеток продуцентов происходит постепенно, а не одновременно? (Р.В.Петров 1982-87) и др.

[51]. Р.М.Хаитов, Г.А.Игнатьева, И.г.Сидрович (2000) – свободные вирусные белки (р 24, рq 120) можно обнаружить в крови человека в 1-е сутки манифестации гриппоподобного синдрома острой ВИЧ инфекции. И это единственная возможность специфической лабораторной диагностики, но только в данный момент времени. Антител в этот период в определяемых количествах еще нет. Через 1-2 сутки перестанут определяться и свободные вирусные антигены, так как появляюшиеся антитела свяжут их в комплексы. Методы анализа с диссоциацией иммунных комплексов в исследовательских целях применимы, но в диагностических целях могут подвести, в силу «капризов» методик. Если какой-то анализ показал наличие инфекции, то результат необходимо подтвердить на независимом диагностикуме и более чем одним независимым методом. Ложноположительные результаты возможны, но вероятность ошибки уменьшается с увеличением числа применяемых методов анализа. В конце концов, по совокупности лабораторных данных можно прийти к определенному заключению о наличии ВИЧ-инфекции. Но обратное утверждение невозможно, в принципе, т.е. сколько бы анализов ни было проведено человеку, конкретно утверждать, что в его организме отсутствует ВИЧ, нельзя. Это объясняется следующими причинами; во-первых, каждая конкретная диагностическая тест-система содержит реагенты, специфичные для уже известных ранее выделенных изолятов ВИЧ. ВИЧ быстро эволюционирует в теле каждого пациента и, следовательно, в целом во времени. Значит, всегда есть вероятностьтого, что, во-первых, у конкретного человека может доминировать в организме такой квазивид ВИЧ, который неузнаваем для диагностических тест - систем, имеющихся в распоряжении конкретной лаборатории. Во-вторых, динамика накопления вируса в организме у каждого человека своя, и сроки сероконверсии (появления в крови специфических против вирусных антител) колеблются от недель до года. Момент заражения неизвестен и теряется в череде событий жизни, включающих многие контакты и связи, при которых могло произойти (или не произойти) заражение. Поэтому никто не может утверждать, что скрывается за отрицательным анализом на ВИЧ: отсутствие вируса в организме или то, что его (а также антител к нему) количества еще не достигли порога доступности для определения тем или иным методом.

[52]. А.Л.Семенихин (2000), Л.Б.Борисов (2002), У.Велиев (2004), Ч.А.Ахмедов (2005), И.М.Гасанов (2006) – диагноз на птичий грипп уточняется серологическим путем (РН, РСК, ИФА, РНГА) спустя 4-7 дней после начала заболевания и спустя 14-16 дней после этого анализом сыворотки крови, взятой у птицы.

[53]. Э.Алиев (2002) – В зависимости от физиологического или патологического состояния организма животного иммунизированного вакциной Шт. 82, бруцеллы в SR фазе могут перейти в R или S формы. Вероятность создания иммунитета в первой форме бруцеллеза заметно снижается, и получают отрицательный ответ при обследовании стандартными антигенами. Относительное большинство S форм бруцеллы увеличивает вероятность порождения заболевания, выделенные из организма разным путем очень опасные в эпизоэпидемиологическом плане.

[54]. Л.Б.Борисов (2002) - практика показала, что все три пункта «Триады Генле - Коха» имеют относительное значение, поскольку далеко не всегда удается выделить возбудителя болезни в чистой культуре и вызвать у подопытных животных заболевание, свойственное человеку. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы были найдены у здоровых людей, особенно после перенесенного заболевания.

Триада сыграла важную роль для установления истинного возбудителя заболевания. Исходя из своей концепции, Кох окончательно доказал, что ранее обнаруженный у животных, больных сибирской язвой, микроорганизм отвечает требованиям триады и является истинным возбудителем данного заболевания.

[55]. Б.Н.Софронов, И.С.Ферйдмин, Л.Б.Борисов – (2002) Иммунные сыворотки и иммуноглобулины используются как средства серопрофилактики и серотерапии. В первом случае сывороточные препараты вводятся до возможного заражения или непосредственно после него, пока еще не появились признаки заболевания, а пациент не обладает собственными антителами, способными защищать его от заражения. Во втором случае препараты вводятся для лечения нейтрализации токсинов или вирусов, усиления антимикробной защиты. Лечебные препараты используются в тех случаях, когда имеются основания считать, что организм не способен обеспечить собственную защиту. Действие препаратов, создающих пассивный иммунитет, начинается быстро сразу после введения, однако срок действия ограничен периодом их сохранения в организме. Кроме того введенные антитела препятствуют развитию активного иммунитета против возбудителя.

[56]. Ф.Н. Мамедзаде, Ш.Х. Курбанов, Р.И. Исмаилова (2002) – После природной иммунизации и вакцинации иммунологические реакции могут быть в определенной степени положительными. Поэтому неимение клинических свойств заболевания не дает основания поставить положительный диагноз на бруцеллез. Получение гемокультуры решает задачу выяснения этиологии заболевания.

[57]. Э.Алиев (2002) – У животных, имеющих в разной степени стойкость к бруцеллезу, между специфическим и неспецифическим факторами имеется противоречивая взаимосвязь. Насколько высоки неспецифические факторы защиты (фагоцитоз, лизоцим, пропердин, комплемент, бактерицидная и опсонизируюшая сила серума крови), настолько показатели специфических факторов иммунитета (агглютинины, гемоагглютины, антитела соединяющие комплемент) бывает низкими. По сравнению с буйволами и крупным рогатым скотом степень диссеминации и эльминации бруцелл в организме зебу совсем отличается. Так, проводимое на зебу, зараженной 250 -500 млн. м.к. дозами бруцелл, бактериологическое засевание на 60 – 90 –112 дней дало отрицательный результат, культура не отделилась, биологическая проба отрицательная.

[58]. Наставление (2002) – 2.8 Диагноз на бруцеллез считается поставленным тогда, когда приобретена вирулентная культура бруцеллеза, которая является возбудителем болезни или получен положительный результат биологической пробы.

[59]. Наставление (2003) – Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфоло¬гическими, культуральными и тинктори¬альными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R-и S-бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно, при отсутствии самоагглютинации в физиоло¬гическом растворе, признают бруцеллами.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контрольные негативную и позитивную бруцеллезную сыворотки в таких же разведениях.

[60]. Э.Алиев(2004) – Бруцеллы крайне стойки на защитные факторы. До преодоления анатомических барьеров и неспецифичной защиты, они претерпевают много изменений. Конечно, здесь важную роль играют вид животного, его возраст и пол, физиологическое положение, факторы внешней среды, пути попадания в организм, вид бруцелл, форма S или R-L. место и количество проникновения.

[61]. А. Инсанов (2004) - чужеродный организм после введения быстро (в течение минут, часов) ликвидируется за счет врожденных природных (резистентность) механизмов сопротивления. Сыворотки глобулинов имеют различные антигены разных спектров. Антигены имеют специфические особенности соединения, усиливают комплимент, ускоряют фагоцитарную активность макрофагов и нейтрализуют бактериальные токсины.

Реактивный С белок пентамерного глобулина образуется в печени. Спустя несколько часов после возникновения травмы или инфекции он переходит в кровяную сыворотку, соединяется с фосфорил холинами на поверхности бактерий, активизирует комплемент, стимулирует фагоцитоз. Этим он выполняет функции похожие на антитела при многих бактериальных инфекциях.

А. Инсанов – Подготовка или активация ответных защитных механизмов против возбудителей определенных специфических болезней. В итоге происходит уничтожение микроорганизмов, болезнь не развивается, а организм приобретает способность сильно противостоять против этого возбудителя, это называют иммунной памятью.

[62]. А. А. Алыев (1994 - 2005), - Бруцеллы под действиям метеорологических факторов внешной среды теряют свою вирулентную способность, но при этом сохраняют очень долгое время свою антигенную способность.

[63]. С.Г.Хаиров, О.Ю.Юсупов, К.В.Шумилов, А.И.Климанов (2005). Проведение ветеринарно - санитарных и других мероприятий, в том числе своевременное полное выявление больных бруцеллезом животных, которое зависит от достоверности и чувствительности методов диагностики, требует значительных затрат труда и материальных средств. Для серологической диагностики бруцеллеза в ветеринарной практике широко используют реакции (РА, РСК, РБП, РДСК, КР и др. Несмотря на специфичность, они не выявляют всех инфицированных животных, особенно в ранние сроки после заражения. Экспери¬ментально заразили вирулентной культурой. Br. abortus 54 в дозе 10 млн м.к. Перед заражением их обследовали на бруцеллез РА, РСК и РДСК с отрицательными результатами. Через 10,20 и 37-48 дней после инфицирования телок обследовали на бруцеллез в РНГА, РА, РСК и РДСК. Становится ясным, что спустя 10 дней все пробы сыворотки крови от 16 телок в РА, РСК и РДСК дали отрицательный результат.

[64]. В статистической информации Государственного Управления Ветеринарии на 2002 –2005 годы, отмечено спорадическое появление бруцеллеза, а в полученной на 2002-2005-ый годы информации отдела статистики и информации Министерства Здравоохранения было отмечено заболевание бруцеллезом около 400 человек.

Бруцеллез является зооантропонозной, то есть переходящей от животного к человеку, инфекцией, с более чем столетней историей. Согласно статистическим данным, каждый год в республике более 200-400 пациентов ставится диагноз бруцеллез на основании имеющихся серологических методов, основанных на поиске специфических антител и их привлекают к лечению. Более чем 2000-х голов пород крупного и мелкого скота ставится диагноз бруцеллез. В отличие от людей, ввиду отсутствия эффективного с экономической точки зрения лечения этого заболевания у животных, их принудительно отправляют на убой, что снижает общую стоимость скота более чем на 50%. Серологические исследования бруцеллеза, такие Роз-Бенгал проба (РБП), реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК) и кольцевая реакция молока, иммуноферментный анализ (ELISA) или другие методы, основанные на поиске специфических антител не отвечают требованиям триады, подтверждающей заболевание, которая была предложена немецким микробиологом Робертом Кохом. Есть несколько признаков, характеризующих инфекционные болезни; развитие болезни периодами, наличие возбудителя, появление специфических антител и иммунитета, направленных против них, наличие характерных клинических симптомов, создание модели болезни при биологических пробах и т.д. Однако, у животных, которым диагноз бруцеллез был поставлен при помощи серологических методов, эти признаки не обнаруживаются. Результаты научных исследований показали, что специфические антитела на антиген бруцеллеза проявляются на 5-й день, на ослабленную вакцину бруцеллеза – на 15-й день, а у морских свинок и кроликов, зараженных экспериментально, специфические антитела на вирулентную бруцеллу в 25% случаев на 30-й день, а в остальных 75% - на 135 дают отрицательную реакцию при серологических исследованиях и положительную – при бактериологических. Т.е., по мере повышения вирулентности бруцелл, период образования специфических антител увеличивается. Что является причиной заражения животных и людей продуктами и выделениями больных животных, распространяющих бруцеллез, вследствие невозможности их выявления с помощью серологических исследований, которые основаны на поиске специфических антител. Возбудители бруцеллеза состоят из соматического антигена и фермента гиалуронидазы. Фермент придает бруцелле инвазивность. Причиной же появления специфических антител является соматический антиген бруцеллы. Антиген в отдельности не способен размножаться и стать причиной заболевания. Ферменты расщепляются при температуре выше 43 С. В ходе проверки полученного результата комиссией было установлено, что даже по истечении 3 часов кипячения соматический антиген бруцеллеза не теряет способности к образованию специфических антител. Мясо бруцеллезных животных консервируется, а молоко – пастеризуется. В случае попадания в человеческий организм вареного мяса или пастеризованного молока с соматическим антигеном бруцеллеза животного, являющегося носителем бруцеллеза, что не может быть установлено в острый период течения болезни серологическими реакциями, служит причиной образования у человека специфических антител в течение 7-10 дней, выявлению бруцеллеза серологическими реакциями Райта, Хеддельсона, лечению химическими бактерицидными противобруцеллезными препаратами и нарушению функций жизненно важных функций. При проведении реакции агглютинации показателей диагностического титра, специфические антитела, добавленные в пробирку, полностью растворяют единицу антигена бруцеллеза (лизис), а реакция биопробы осадка на РБП, КРП пробы дает отрицательный результат. Во время биологических исследований последующих титров антиген бруцеллеза в пробирке не подвергается лизису, что является причиной образования специфических антител. Если этот процесс происходит in vivo, идет очищение организма от бруцеллеза и человек не может заразить других людей. Это называется «биологическим тупиком»! Принимая во внимание принудительный убой скота с диагнозом бруцеллез, лечение людей противобруцеллезными антибактериальными химическими препаратами и отсутствие обнаружения организмов, распространяющих вирулентные микробы, имеющимися серологическими методами, основываясь на результатах специфических антител, авторы советуют использовать серологические методы, основанные на поиске специфических антител, только для определения иммунного статуса. Тогда как для диагностики бруцеллеза рекомендуется использовать новый метод исследования с условным названием Триада реакций “ABNUREL” (комплексная оценка бактериологических, серологических, биологических проб и Кольцевой Реакции Преципитации (КРП).

Вследствие различного иммунного состояния животного поставить диагноз при помощи имеющихся серологических методов в различные периоды течения болезни вызывает сложности. Серологические методы, основанные на поиске специфичных антител, не выявляют в полной мере организмы, распространяющие бруцелл, требует поиска других адекватных способов диагностики бруцелл в массовом количестве. Невыяснение проблемы создает препятствия на пути диагностики заболевания и совершенствования лечения; более эффективные методы лечения не были до сих пор разработаны именно по этот причине!

Применение результатов, полученных нами, в соответствующих отраслях стимулирует проведение специфической профилактики заболевания и облегчит лечение, что стимулирует экономический рост, обеспечит пищевую безопасность, искоренит имеющиеся проблемы и сыграет важную роль в искоренении болезни. Разрешение этой проблемы в мире и в республике важно именно с этой точки зрения.

Выпадение в осадок единицы бруцеллезного антигена in vitro со специфической бруцеллезной сывороткой в электролитической среде называется бактериолизисом.

Таблица № 1

1.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл

0.1 S 0.05 S 0.025 S 0.0125S 0.00625 S

+ + + + +

2.4 F 0.5 F 0.5 F 0.5 F 0.5 F

+ + + + +

0.5 A 0.5 A 0.5 A 0.5 A 0.5 A

осадок осадок осадок осадок осадок

0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл 0.5 мл

0.3 S 0.15 S 0.075 S 0.375 S 0.01875 S

+ + + + +

1.2 F 0.5 F 0.5 F 0.5 F 0.5 F

+ + + + +

0.5 A 0.5 A 0.5 A 0.5 A 0.5 A

осадок осадок осадок осадок осадок

Серологические методы, используемые в настоящее время в диагностике бруцеллеза основаны на поиске в сыворотке крови специфических антител. Реакция агглютинации у животных, овец и коз во время обследования ставится в пропорции 1: 25, 1: 50, крупного рогатого скота 1: 50, 1: 100. В первичном разбавлении берется 0,1 мл исследуемой сыворотки для обследования, разбавляется в указанной пропорции физиологическим раствором и к нему добавляется 0,5 мл единица бруцеллезного антигена, разбавленного физиологическим раствором в пропорции 1: 10. В 1 мл единицы бруцеллезного антигена содержится 10 млрд. клеток бруцеллы. При изготовлении 1 – мл раствора в пропорции 1: 10 в 1мл остается 1 – млрд. микробных клеток, при добавлении 0,5 его к сыворотке в каждую пробирку попадает 50 миллионов бруцеллезных клеток. Если у крупного рогатого скота наблюдается 1: 100, у овец, коз 1: 50 минимум 2 ++ агглюцинация, рекция считается положительной, а животное – зараженным бруцеллезом. Если 0,1 мл исследуемой сыворотки в разбавлениях 1: 50; 1: 100 “in vitro” (в пробирке) подвергает лизису 500 миллионов бруцеллезных клеток, в электролитической среде спустя 18 – 24 часа, то у животного, с 20 – ю литрами крови сыворотка составляет как минимум 45%, что равняется примерно 9 л сыворотки. Насколько эффективно возможно нейтрализовать бруцелл «in vivo» в пробирке наглядно иллюстрируют математические вычисления. Могут ли в таких случаях эти организмы считаться опасными, зараженными или заразными? Естественно нет! Так как противоречивые источники еще раз подтверждают вышесказанное. Таблица 1.

Кроме того, 45 морским свинкам проводилась иммунизация единицей бруцеллезного антигена в 1 – й день 1 мл, на 6 - й день 2 мл, на 14 – й день 2,5 мл в бедренну область внутримышечно. На 21-й день был измерен титр сыворотки РА, самый низкий титр равнялся 1: 160, верхний же - 1: 1280. Далее осадок из пробирок обоих титров использовался для иммунизации различных морских свинок от 1: 5 до 1: 1280, спустя 5 дней были получены следующие результаты: АР верхняя граница титра осадка сыворотки 1: 160, разбавленной до 1: 5, 1: 10, 1: 20, была использована спустя 18 – 24 часов для иммунизации морских свинок специфические антитела не образовывались, а от осадка последующих титров – появлялись. АР верхняя граница титра осадка сыворотки 1: 1280 осадка сыворотки разбавленной до 1: 5, 1: 10, 1: 20, 1: 40, 1: 80 специфические антитела не образовались, однако при использовании осадка свыше 1: 160 специфические антитела образовались. Лпыты повторялись 3 раза, результаты были идентичны.

Защита организма от инфекционных и неинфекционных веществ называется иммунитетом. Таблица № 2

I Бактериологическая система

II Гемолитическая

система

Гемолиз

отсутствует

Гемолиз

наблюдается

II Гемолитическая система

Реакция положительна, гемолиз отсутствует

Комплимент соединен в бактериолитической системе,

Животное считается больным.

I Бактерилитическая система

И. Борде, О. Жангу (1901) – соединив комплемент при добавлении реакции бактериолиза и гемолиза, воспроизвели реакцию соединения комплемента. Реакцию связывания комплимента впервые в 1901-м году описали Борде и Джангу, в 1909 - было предложено Гольтом в целях диагностики бруцеллеза, которая и по всей день используется в качестве наиболее точного метода. В реакции комплимента в качестве сыворотки используется сыворотка мужской особи морской свинки. Комплиментарность является показателем бактерицидности крови. Что основано на принципе свободной фиксации комплемента в реакции антиген - антитело. Эта реакция является основой 2 таких феноменальных реакций, как бактериолиз и гемолиз. Немецкий исследователь Ричард Пфайфер и русский микробиолог В.И.Исаев наблюдали специфические антитела в сыворотке крови животных у морских свинок при вакцинировании их ослабленным холерным вибрионом - бактериолизины. При добавлении к полученной сыворотке крови в пробирке живых холерных вибрионов происходит лизис с участием комплиментов. Поэтому рекция была названа бактериолизисом. Феномен гемолиза же наблюдали Борде, Ф. Чистович в 1898 г. - подсаживанием к островным кроликам овечьих эритроцитов с увеличением дозы в 3 раза. В результате развилась гипериммунизация, новообразованные специфические антитела в присутствии комплимента "in vitro" подверг лизису эритроциты барана, что сопровождалось покраснением цвета. Это событие было названо реакцией гемолиза. Таблица 2

. В 3-м исследовании единица бруцеллезного антигена в каждй пробирке по 4 - мл кипятились в воде с интервалами в 30, 60, 90, 120, 150, 180 минут, каждый образец инъецировали 2 - м морским свинкам энтерально, подкожно, интраперитонально и внутримышечно. Спустя 5 дней результаты на проверку оказались положительными. Антиген сохранил способности производить специфические антитела даже спустя 3 часа кипения при температуре кипячения. В течение 5 дней с момента формирования специфических антител на 7-10 день в случае специфического образования антител в энтеральной иммунизации было утверждено Комиссией Аз. НИВИ в 2008 году. Таблица 3.

Антигенный показатель бруцеллы отражает не патогенность, а иммунитет.

Таблица № 3

Ряд

№

Бирка

№ Единица бруцеллезного антигена 1989 Единица бруцеллезного антигена 2008 Серологическое исследование крови до иммунизации Серологическое исследование крови до иммунизации на 7-30 день Заметки

ВНУТР

5 мл Подкожно

2,5 мл ВНУТР

5 мл Подкожно

2,5 мл РБП РА РБП РА

1 600 В - обследован + 1:2560

2 589 В - "-----------" + 1:640

3 587 В - "-----------" + 1:40 Самец

4 588 П - "-----------" - - Беременная

самка

5 584 П - "-----------" - - Беременная

самка

6 585 П - "-----------" - - Самец

7 583 П - "-----------" - - Беременная

самка

В течение 3-х часов кипяченный

Е.Б.A

8 582 В - "-----------" - - Самец

9 586 П - "-----------" + 1:160

10 571 В - "-----------" + 1:80

11 570 П - "-----------" - - Беременная

самка

12 572 П - "-----------" - - Беременная

самка

13 573 В - "-----------" + 1:80

14 574 В - "-----------" + 1:40

15 575 П - "-----------" + 1:160

16 576 П - "-----------" + 1:2560

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Из опытов нам стало известно, что специфические антитела образуются на 4 - 5 – й день при единичном антигене бруцеллеза, спустя 11 - 14 дней образуются специфические антитела к антигену, приготовленному из вакцины REV-1. Разница антигена, приготовленного из данного штамма вакцины, от антигена единичного бруцеллеза при РКП, составляет не 16 - 30 минут, а является причиной задержки реакции на 3 часа, что считается поводом браковки животного при его инфицировании вакциной вирулентного микроба.

2. В острой фазе инфицирования бруцеллезом результаты бактериологического, биологического, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Триады «ABNUREL» положительные, а при соответствующих серологических исследованиях (РБП, РА, РСК, КРМ и ИФА) – отрицательные. Положительные ответы соответствующих серологических методов при бактериологическом и биологическом исследованиях, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции Триады «АБНУРЭЛЬ» являются отрицательными. Новые методы исследования показали специфический рост бруцелл в течение 72 часов. Результаты биологической пробы оцениваются в сравнении с контролем спустя 5 дней. Компоненты реакции, помимо того, что являются частью местного производства, легки, и рациональны с точки зрения экономики и доступности для массового исследования. Здорового животного отправляют на экспертизу спустя 72 часа, а больного животного – спустя 8 дней. Преимуществом указанного метода исследования является то, что благодаря ему удается отделить животных с приобретенным стерильным иммунитетом, заболевших бруцеллезом, привитых или со слабой иммунной системой от организмов, дающих перекрестную агглютинацию и предотвратить отправку этих животных на принудительный убой в перемежку с другими.

3. Согласно новой методике, кровь берется стерильными 1-, 3-, 5- и 10-граммовыми шприцами, тут же на месте делается посев в бульоне. Впервые усовершенствуется бактериологический, биологический методы и рабочий режим пищевых сред РКП. Ввиду того, что показатели диагностического титра есть бактериолизис in vitro, они являются показателем естественного оздоровления от бруцеллеза. Во время проведения биологической пробы, направленной против имеющегося в пробирке диагностического титра, спустя 18 часов после РА осадка in vitro специфические антитела не образуются, однако, в последующих титрах они бывают обнаружены.

4. Острая фаза смертельной дозы инфицирования бруцеллезом при интраперитональной иммунизации в эксперименте 1: 1280 титре сыворотки больного животного 6,5 мл 2 раза с перерывом в 1 день стала причиной выздоровления умирающего кролика. Однако, результаты серологических реакций были положительными, через 10 дней у тех же кроликов при посеве из селезенки, печени, лимфатических узлов и костного мозга трубчатых костей и новых жидкостей, при посеве из твердых питательных сред. В итоге специфический рост не наблюдается, в суспензиях из органов 1:10 проведено биологическое испытание на 2 кроликах каждого рода, спустя 5 дней при РБП результаты были отрицательными, в контроле в течение этого же времени антиген, приготовленный из антигена единичного бруцеллеза и вакцины REV-1, был инъекцирован, сыворотка крови против антигена единичного бруцеллеза на 4 - 5 - й день против антигена, приготовленного из Rev – 1, - спустя 11 - 14 дней при РБП и РА титре 1: 80 была положительной. При 5 - 6 посевах вакцины REV-1 в пищевых средах ее патогенность для кроликов и крыс увеличивается, приготовленная из нее против антигена титр 1 : 2560 сыворотка специфического гипериммунного бруцеллеза явилась причиной очищения бруцелл в организме крыс, однако, из - за активизации секундарных инфекций крысы погибли. Это означает небходимость применения обезболивающих средств, антибиотиков и иммуномодуляторов в дальнейшем параллельно с гипериммунной сывороточной терапией.

5. Полученные при помощи антигена бруцеллеза результаты нельзя приравнивать к патогенным бруцеллам, потому что антигену бруцеллы присуща длительная устойчивость в чужой среде, даже после 3 - часового кипячения он не теряет способности образовывать специфические антитела. При постановке диагноза бруцеллеза обязательно надо учитывать это его свойство!

6. После приобретенного естественным путем стерильного иммунитета и вакцинирования иммунологические реакции могут быть в любой степени положительными, при отсутствии клинических признаков заболевания положительные серологические реакции на бруцеллез не дают основание ставить диагноз, выделение гемокультуры, положительный ответ биологического проба подтверждают диагноз.

7. Согласно указу №13 от 21.04.2014 Государственной ветеринарной Службы при Министерстве Сельского Хозяйства Азербайджана для сравнения нового диагностического метода с имеющимися методами, были взяты образцы крови и молока у 25 больных и 20 здоровых единиц скота, предоставленными Ветеринарной лабораторией Губинского района для проведения диагностики как имеющимися, так и новыми методами. Пробы были переданы в Республиканскую ветеринарную лабораторию и проверены бактериологической, ПЦР, ELISA и новой методиками. Согласно полученным даныым, при проверке ПЦР из 25 проверенных животных только 5 было объявлено больным. Согласно результатам теста ELISA İg G у 2-х из 24 больных животных было отрицательным, а у остальных – положительным, В тоже время, у 9 из 10 здоровых животных İg G был положительным. Сравнительные результаты оценки бактериологического и нового способов подтвердили, что 25 единиц скота здоровы, в то время как ПЦР показало, что 80% животных 20 голов не болеет, а ELISA - из 25 больных голов у 22 выявилась положительная реакция, из 20 здоровых - 9 положительных. У здоровых и больных животных средний показатель температуры был равен 38,8 C. При визульном осмотре характерные признаки заболевания не наблюдались.

ЛИТЕРАТУРА

1. М.К. Юсковец - Бруцеллез селъкохозяйственных животных. Москва 1960.

2. Вопросы инфекцищнной патологии и иммунологии. Москва, 1968.

3. E.Əliyev - Kənd təsərrüfatı heyvanlarının bruselyozu və onunla mübarizə tədbirləri, 1980, Bakı На Азербайджанском языке.

4. Р. А. Кадымов, Э. М. Агаева, З . А. Алескеров - Основы иммунитета сельскохозяйственных животных, Баку - Элм, 1992.

5. Э.Н. Шляхов иммунология иммунодиагностика, иммуно - профилактика инфекционных болезней. Кишинев, 1997.

6. E.Əliyev - Kənd təsərrüfatı heyvanlarının bruselyozu. Bakı, 2002 На Азербайджанском языке.

7. Иммунитет и инфекция – П. Е. Игнатов Москва, 2002

8. Иммунология - Е.С. Воронин, А.М.Петров, М.М.Серых, Д.А.ДевришовМосква, 2002

9. Л.Б.Борисов - Медицинская микробиология,вирусология, иммунология Москва, 2002

10. А.А. Воробев - Медицинская микробиология,вирусология, иммунология Москва, 2004

11. Н.В. Медуницын, В.И. Покровский. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней. Москва. Издателъслая группа «ГЭОТАР - Медиа», 2005

12. Д .И. Скородумов, В .В. Субботин, М.А. Сидоров, Т. С. Костенко. Микробиологическая диагностика бактериалъных болезней животных. Москва, 2005

13. В.А. Галынкин, Н.А. Заикина,В.И. Кочеровец, И.З.Курбанова. Питательные среды. Санкт – Петербуруг, 2006.

14. Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов Ветеринарная микробиология и иммунология. Москва Колосс, 2006

15. Инфекционные болезни животных. Москва, «Колосс» 2007.

16. М.С.Поляк,В.И. Сухаревич.Питателъные среды для медицинской и санитарной микробиологииСанкт Петербург, 2008

17. Животная клетка в кулътуре (методы и применение в биотехнологии) - Москва, 2009

18. Иммунология - Р.М. Хаитов 2009, Москва